细胞工程思维导图

I. 细胞工程总览

• 定义： 利用细胞生物学和分子生物学原理，对细胞进行人为改造，以获得具有特定功能的细胞或细胞产物的技术。
• 核心思想： 细胞是生命活动的基本单位，通过改变细胞的遗传物质或调控其表达，改变细胞的生命活动。
• 应用领域：
  • 医学：疾病治疗（基因治疗、细胞治疗）、药物筛选、疫苗研发、组织工程。
  • 农业：育种（抗逆、高产）、畜牧业（转基因动物、提高产量）、病虫害防治。
  • 工业：发酵工程、生物制药、生物能源、环境治理。
  • 基础研究：研究细胞生命活动规律、疾病发生机制等。
• 基本技术：
  • 细胞培养：体外培养细胞，提供生长环境。
  • 细胞融合：将不同来源的细胞融合，形成杂交细胞。
  • 细胞转染/转导：将外源基因导入细胞，改变细胞遗传特性。
  • 基因编辑：精确修改细胞基因组中的特定基因。
  • 单克隆抗体技术：制备特异性强的抗体。

II. 细胞培养

• 定义： 在体外模拟体内环境，为细胞提供生长、繁殖的条件，使细胞能在体外存活、生长和繁殖的技术。
• 类型：
  • 按细胞来源：
    • 原代培养：直接从生物组织中分离得到的细胞，通常寿命有限。
    • 传代培养：将原代培养的细胞进行分割，进行再培养，可延长细胞寿命。
    • 细胞系：具有无限增殖能力的细胞，通常经过诱变或转化而来。
  • 按培养方式：
    • 贴壁培养：细胞贴附在培养容器表面生长。
    • 悬浮培养：细胞悬浮在培养液中生长。
• 培养条件：
  • 营养：
    • 培养基：提供细胞生长所需的碳源、氮源、无机盐、维生素、生长因子等。
    • 血清：提供未知生长因子、激素等，促进细胞生长。
  • 温度：通常为37℃，根据细胞类型而定。
  • pH：通常为7.2-7.4，需维持恒定。
  • 气体：CO2（维持pH）、O2（细胞呼吸）。
  • 湿度：维持高湿度，防止培养液蒸发。
  • 无菌环境：防止微生物污染。
• 应用：
  • 细胞模型：用于研究细胞生理、病理过程。
  • 药物筛选：评估药物对细胞的毒性、药效。
  • 生物制品生产：生产疫苗、抗体、酶等。
  • 组织工程：构建人工组织、器官。
• 相关技术：
  • 细胞分离：从复杂混合物中分离特定类型的细胞。
  • 细胞冻存：将细胞冷冻保存，长期保存细胞资源。
  • 细胞计数：确定细胞数量，评估细胞生长状态。
  • 细胞鉴定：确定细胞类型，验证细胞纯度。

III. 细胞融合

• 定义： 将两个或多个细胞融合形成一个杂交细胞的技术。
• 类型：
  • 自然融合：细胞之间自然发生的融合，效率很低。
  • 诱导融合：通过物理、化学或生物方法诱导细胞融合。
    • 物理方法：电融合、机械融合。
    • 化学方法：PEG（聚乙二醇）诱导融合。
    • 生物方法：灭活的病毒（如仙台病毒）诱导融合。
• 机制：
  • 细胞膜的相互接触和融合。
  • 细胞质的混合。
  • 细胞核的融合。
• 应用：
  • 单克隆抗体技术：制备杂交瘤细胞，生产单克隆抗体。
  • 细胞遗传学研究：研究染色体结构、基因定位。
  • 肿瘤细胞研究：研究肿瘤细胞的特性。
  • 基因转移：将一个细胞的基因转移到另一个细胞。
• 单克隆抗体技术 (详细):
  • 原理：利用B淋巴细胞产生抗体的特性，与骨髓瘤细胞融合，形成既能产生抗体又能无限增殖的杂交瘤细胞。
  • 过程：
    • 免疫动物：将抗原注射到动物体内，刺激B淋巴细胞产生抗体。
    • 分离B淋巴细胞：从动物脾脏中分离B淋巴细胞。
    • 细胞融合：将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合。
    • 筛选杂交瘤细胞：筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。
    • 克隆化：将杂交瘤细胞进行克隆化，获得纯系细胞。
    • 培养：将杂交瘤细胞进行培养，生产单克隆抗体。
  • 优点：特异性强、纯度高、产量大。
  • 应用：疾病诊断、治疗、科学研究。

IV. 细胞转染/转导

• 定义： 将外源基因导入细胞的过程。
• 类型：
  • 瞬时转染：外源基因在细胞内短暂表达，不整合到宿主基因组中。
  • 稳定转染：外源基因整合到宿主基因组中，并随细胞分裂而稳定遗传。
• 方法：
  • 物理方法：
    • 显微注射：直接将DNA注入细胞核。
    • 基因枪：将DNA包裹在微小颗粒上，高速射入细胞。
    • 电穿孔：利用电脉冲在细胞膜上形成孔，使DNA进入细胞。
  • 化学方法：
    • 磷酸钙沉淀法：DNA与磷酸钙形成沉淀，被细胞吞噬。
    • 脂质体转染：DNA包裹在脂质体中，通过膜融合进入细胞。
    • 阳离子聚合物转染：DNA与阳离子聚合物结合，通过内吞作用进入细胞。
  • 病毒载体：
    • 逆转录病毒：将DNA整合到宿主基因组中，稳定转染。
    • 腺病毒：不整合到宿主基因组中，瞬时转染。
    • 腺相关病毒：安全性高，可用于基因治疗。
• 应用：
  • 基因功能研究：研究基因的功能。
  • 基因治疗：将正常基因导入患者细胞，治疗遗传性疾病。
  • 蛋白质生产：生产重组蛋白质。
  • 细胞模型构建：构建基因工程细胞模型。

V. 基因编辑

• 定义： 利用基因编辑工具对细胞基因组中的特定基因进行精确修改的技术。
• 技术：
  • ZFN (锌指核酸酶)
  • TALEN (转录激活因子样效应物核酸酶)
  • CRISPR/Cas9 (规律成簇的间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9)
• CRISPR/Cas9 (详细):
  • 原理：利用sgRNA（向导RNA）引导Cas9蛋白到靶基因位置，Cas9蛋白切割DNA，细胞修复DNA时发生基因编辑。
  • 过程：
    • 设计sgRNA：根据靶基因序列设计sgRNA。
    • 构建表达载体：将sgRNA和Cas9基因克隆到表达载体中。
    • 细胞转染：将表达载体转染到细胞中。
    • 基因编辑：Cas9蛋白在sgRNA的引导下切割靶基因，细胞修复DNA时发生基因编辑。
    • 筛选：筛选出基因编辑成功的细胞。
  • 优点：操作简单、效率高、成本低。
  • 应用：
    • 基因功能研究
    • 疾病模型构建
    • 基因治疗
    • 农业育种
• 伦理问题： 基因编辑技术的伦理问题，特别是应用于人类生殖细胞的基因编辑，需要严格监管。